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一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂及其应用

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成果类型:
专利
发明/设计人:
唐青海;杨海;杨灿;王芳宇;何丽芳;...
申请/专利权人:
衡阳师范学院
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2020-02-28
申请/专利号:
CN202010129320.2
公开时间:
2020-06-05
公开号:
CN111228482A
主申请人地址:
421000 湖南省衡阳市珠晖区衡花路16号衡阳师范学院
申请地区:
中国湖南
代理人:
王加岭
机构署名:
本校为其他完成单位
主权项:
1.一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂,其特征在于:所述复合制剂由犬细小病毒卵黄抗体、噬菌体制备而成,其中所述噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19,其保藏号为CGMCC No.17584。 2.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂,其特征在于,所述犬细小病毒卵黄抗体是采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡,然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体,所述犬细小病毒CPV-HuN1703株微生物保藏编号为CGMCCNo.17583。 3.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤: (1)制备犬细小病毒卵黄抗体; (2)噬菌体悬液的培养; (3)药物制剂的制备。 4.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法,其特征在于,所述制备犬细小病毒卵黄抗体的方法包括如下步骤: (1)制备犬细小病毒抗原; 步骤a,按照常规方法培养猫肾传代细胞F81:生长液为含5%胎牛血清的MEM(含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL),在37℃,5%CO2 培养箱中培养传代,待细胞生长至80%汇合度时,用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基; 步骤b,取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞,37℃吸附1 小时,弃去吸附液,补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养; 步骤c,接毒后,每日观察3 次,记录细胞病变(CPE)情况,待细胞病变率达80%以上时进行收获,-80℃反复冻融三次,8000 rpm 离心15min,收集上清液,即为病毒液; 步骤d,将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后,加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液; 步骤e,将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂案1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀,即制得所述犬细小病毒抗原; 所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/mL; 其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂; (2)免疫蛋鸡: 采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡,首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原,免疫剂量为1ml/只;首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫,免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只;第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋,测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价,收集抗体效价为1:256以上的卵黄液,用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备; (3)从免疫鸡蛋中制备抗体原液: 将收集的免疫鸡蛋经75%酒精消毒后,用卵黄分离器分离蛋白,收集卵黄,先后加入2倍体积的PBS 缓冲液(0.01M,pH7.2)和1/2体积氯仿充分振荡,离心后收集上清液,先后用50%和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体,最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中,4℃透析24小时,经0.22μm滤膜过滤后,置于温度为54~60℃的环境中,保持8~20小时,进行病毒的灭活,获得抗体原液,即为纯化的卵黄抗体。 5.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法,其特征在于,所述噬菌体悬液的培养方法为:噬菌体悬液的制备:将噬菌体Phage-HY19 按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19(大肠埃希氏菌,Escherichia coli,保藏号为CGMCC No.17622)培养液中,再加入CaCl2 至终浓度1mM,37℃,150rpm 摇振培养12h,12000×g,4℃,离心10min,取上清,上清液经0.22μm 的无菌滤器过滤,而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM,调整滴度至4×108pfu/mL,得到噬菌体悬液。 6.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法,其特征在于,所述药物制剂的制备方法包括: 步骤一,将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合; 步骤二,向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉,室温下搅拌均匀,得到悬浮液; 步骤三,将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合,充分混匀后,加入步骤二的悬浮液体积3%的CaCl2 溶液(质量浓度为5%),充分混匀后经喷雾干燥设备脱水,制剂粒径分布在15-50μm,制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。 7.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂在制备用于治疗犬腹泻药物中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用,所述犬优选为幼犬。
摘要:
本发明提供的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂,包括高抗体效价、对于犬细小病毒病具有良好的防治作用的卵黄抗体以及对于大肠杆菌ETEC具有良好裂解作用的噬菌体,一方面可以有效的治疗CPV感染,另一方面可以杀灭肠道内致病的大肠杆菌ETEC,避免了幼犬腹泻进展为出血性肠炎,能够有效的治疗由CPV和大肠杆菌ETEC导致的腹泻,其相比抗生素治疗,能够缩短腹泻的天数,同时提高动物的存活率。

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