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一种犬细小病毒卵黄抗体及其制备方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
唐青海;杨海;杨灿;王芳宇;何丽芳;...
申请/专利权人:
衡阳师范学院
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2020-02-28
申请/专利号:
CN202010129321.7
公开时间:
2020-12-15
公开号:
CN112079916A
主申请人地址:
421000 湖南省衡阳市珠晖区衡花路16号衡阳师范学院
申请地区:
中国湖南
代理人:
王加岭
机构署名:
本校为其他完成单位
主权项:
1.一种犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡,然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体,所述犬细小病毒CPV-HuN1703 株,其微生物保藏编号为CGMCC No.17583;分类命名:犬细小病毒(CanineParvovirus,CPV);保藏时间是2019 年04 月24 日;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号,中国科学院微生物研究所。 2.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,所述犬细小病毒卵黄抗体的制备方法包括如下步骤: (1)制备犬细小病毒抗原; (2)免疫蛋鸡; (3)从免疫鸡蛋中制备抗体原液; (4)检测抗体效价。 3.根据权利要求2所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述制备犬细小病毒抗原的方法包括如下步骤: 步骤a,按照常规方法培养猫肾传代细胞F81:生长液为含5%胎牛血清的MEM(含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL),在37℃,5%CO2培养箱中培养传代,待细胞生长至80%汇合度时,用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基; 步骤b,取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞,37℃吸附1 小时,弃去吸附液,补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养; 步骤c,接毒后,每日观察3 次,记录细胞病变情况,待细胞病变率达80%以上时进行收获,-80℃反复冻融三次,8000 rpm 离心15min,收集上清液,即为病毒液; 步骤d,将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后,加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液; 步骤e,将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂案1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀,即制得所述犬细小病毒抗原。 4.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703 株≥5.5×105TCID50/mL。 5.根据权利要求3-4任一项所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。 6.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述免疫蛋鸡的方法是:采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡,首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原,免疫剂量为1ml/只;首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫,免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只;第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋,测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价,收集抗体效价为1:256以上的卵黄液,用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备。 7.根据权利要求3所述的犬细小病毒卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述从免疫鸡蛋中制备抗体原液的方法是:将收集的免疫鸡蛋经75%酒精消毒后,用卵黄分离器分离蛋白,收集卵黄,先后加入2倍体积的PBS 缓冲液(0.01M,pH7.2)和1/2体积氯仿充分振荡,离心后收集上清液,先后用50%和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体,最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中,4℃透析24小时,经0.22μm滤膜过滤后,置于温度为54~60℃的环境中,保持8~20小时,进行病毒的灭活,获得抗体原液,即为纯化的卵黄抗体。 8.一种犬细小病毒卵黄抗体,其采用权利要求1-7任一项所述方法制备得到。 9.根据权利要求8所述的犬细小病毒卵黄抗体在制备用于治疗CPV感染导致的疾病的药物中的应用。 10.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求8所述的犬细小病毒卵黄抗体和药学上可接受的载体。
摘要:
本发明基于一株致病性较强、具有良好免疫性能的强度毒株CPV‑HuN1703株制备得到卵黄抗体,该卵黄抗体中和效价高,对于犬细小病毒病具有良好的防治作用,优于其他分离毒株所制备得到的卵黄抗体。该卵黄抗体具有安全、特异性高、治疗效果好、生产成本低等优点,可有效防治犬细小病毒引起的疾病,具有良好的应用前景。

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